磁弛豫生物传感器在食品安全快速检测中的应用研究进展（二） 快速使磁探针数量发生变化

2)基于磁颗粒数量变化的磁弛MRS。基于磁颗粒数量变化的豫生应用研究MRS是一种新型的磁弛豫生物传感分析方法。其基本原理是物传基于大小不同的磁颗粒在同一磁场中的分离速度的差异，将大粒径的感器磁颗粒作为免疫磁分离的载体，小粒径的食品磁颗粒作为磁信号探针，通过修饰有给体/受体的安全载体特异性识别修饰有受体/给体的磁颗粒，经磁分离等操作后，快速使磁探针数量发生变化，检测进展从而实现生物传感。磁弛相对于基于磁颗粒状态改变MRS，豫生应用研究该类型传感器不需要诱导磁颗粒的物传聚集，有效提高了MRS的感器稳定性。此外，食品T2信号对磁探针的安全浓度的改变更为敏感，具有更高的快速响应，有效提高了MRS传感器的灵敏度。关于磁颗粒数量变化介导的MRS生物传感器的研发，国内外均有此方面的报道。Chen等将磁分离(magneticseparation，MS)与MRS相结合，构建了一种基于磁颗粒数量变化的MRS生物传感平台，并成功应用于致病菌与病毒的快速检测(图2B)。

该方法主要基于大粒径磁颗粒(250nm磁颗粒，MNP250)与小粒径磁颗粒(30nm磁颗粒，MNP30)在小磁场(0.01T)中具有不同的分离速度，MNP250由于具有高饱和磁化强度，能够在1min内被0.01T磁场快速分离，而MNP30由于饱和磁化强度较低，在相同条件下，60min尚不能磁分离完全。Chen等将MNP250作为磁分离的载体并偶联捕获抗体，将MNP30作为磁信号探针并偶联检测抗体，当目标物存在时，经过特异性免疫反应能够形成MNP250G目标物GMNP30双抗夹心结构。由于磁分离速度的不同，可以轻易地将MNP250G目标物GMNP30与反应体系中未反应的MNP30分离，从而获得未反应的MNP30，对其进行T2信号测定，实现定量分析。该方法集样品富集、提取、检测一步完成，整个免疫分析过程能够在30min内完成，操作简单，灵敏度高，具有良好的快速检测的潜力。

此外，2013年，Weissleder课题组基于磁颗粒GDNA探针，结合分子杂交实验，构建了临床样品中致病菌的生物传感器分析系统(图2C)。此工作通过RTGPCR技术对所提取RNA的目标区域进行特异性扩增，得到大量的单链DNA，此DNA能够被偶联有寡核苷酸捕获探针的聚合微球所捕获，得到聚合微球GDNA，聚合微球GDNA进而与偶联有检测探针的磁颗粒(MNP)结合，得到聚合微球GDNAGMNP，由于大量MNP结合到聚合微球上，可显著降低周围水分子的T2值。该方法实现了三步信号扩增：(1)PCR扩增；(2)聚合微球对目标核酸分子的捕获与富集；(3)磁信号扩增。该方法稳定快速，能够在2h内同时诊断临床标本中的13种细菌。更重要的是，其课题组所使用的微型核磁共振仪为快速检测提供了有力的工具。Lu等构建了一种基于磁颗粒数量变化的MRS生物传感方法，并将其用于微小RNA(MicroRNA，miRNA)的高灵敏定量分析(图2D)。

miRNA是一种小的、非编码的RNA分子，由大约22个核苷酸组成，参与基因表达的转录和调控。miRNA的异常表达可能导致DNA扩增或易位，导致肿瘤增生或转移，其快速准确检测能够为临床诊断及癌症治疗提供重要的参考依据。此工作组装了一种“大磁颗粒GDNAG小磁颗粒”(MM1000GDNAGMN30)磁探针，当目标miRNA存在时，双链特异性核酸酶(DSN)能够特异性切割通过杂交生成的DNAGRNA异源双链核酸分子，从而引导miRNA和MN30的释放，释放的MN30通过不同粒径磁颗粒分离速度的不同与磁探针进行分离，最后对上清液中MN30的进行定量分析。与传统MRS相比，此方法能够在目标物存在的情况下，直接释放MN30，并将其作为信号源进行信号读出，是一种信号打开的方式，稳定性良好。此外，释放的miRNA又可以作为目标物进行新一轮的杂交反应，释放MN30，使得信号放大，显著提高传感方法的灵敏度，能够实现尿液样品中miRG21高灵敏的一步检测(5fM)，在临床即时诊断方向具有良好的应用前景。。

3)磁颗粒状态与数量同时变化的MRS。在检测农兽药残留等小分子有害物质时，农兽药小分子通常只有一个可以和抗体特异性结合的位点，引起的磁信号改变微弱，导致传统MRS灵敏度无法对小分子目标物实现痕量检测。为了解决此问题，Zheng等构建了一种基于生物正交反应进行信号级联放大，集磁颗粒状态与数量变化于一体的MRS传感平台，并将其用于农药残留毒死蜱的痕量分析。毒死蜱因其广谱性，已成为农业生产中广泛使用的有机磷杀虫剂。然而，长期接触有机磷农药会对人体神经系统、生殖系统和免疫系统造成损害，对人体健康构成严重威胁。在本方法中，毒死蜱分子会与MNP1000GBSAG毒死蜱竞争性结合二苯并环辛炔(DBCO)修饰的单克隆抗体(AbGDBCO)，得到的“MNP1000GBSAG毒死蜱GAbGDBCO”复合物上具有多个DBCO位点，能够捕获大量的azideGMNP30(DBCO能够与叠氮化物(azide)发生生物正交反应)，通过磁分离效率的不同可得到未反应的azideGMNP30(磁颗粒数量变化)，通过加入生物交联剂DBCOGPEG4GDBCO进一步诱导DBCO和叠氮化物基团之间的生物正交反应使分散的azideGMNP30聚集(磁颗粒状态变化)。试验结果表明，该传感器能够实现对毒死蜱0.1~1000ng/mL的定量检测，检出限为0.05ng/mL。该传感器的高效与高灵敏主要得益于：

(1)叠氮化物与DBCO的生物正交反应具有快速、高选择性的特点，是实现信号放大而不引入交叉反应的重要手段，特别是在复杂样品中；

(2)单一抗体对azideGMNP30显示出多个DBCO位点，这将增大由单个靶标诱导MNP30的结合量，从而使信号放大；

(3)生物交联剂DBCOGPEG4GDBGCO诱导的azideGMNP30聚集，使传感信号进一步放大。该传感器通过生物正交反应将MNPs数量变化引起的信号放大与MNPs状态变化引起的信号放大有机结合起来，实现磁信号的级联放大，有效提高了生物传感器的灵敏度和检测范围。

Wu等利用碱性磷酸酶介导的点击化学反应作为信号转化与放大系统，构建了双重模式的MRS生物传感器。该工作通过Cu＋催化叠氮化物和炔的1，3G偶极环加成的点击化学反应(CuAAC)诱导磁颗粒的状态变化或调节磁探针数量变化。如图2E所示，当小分子目标物存在时，包被在96孔板上的目标物GBSA能够与目标物竞争性结合单克隆抗体(Ab)，洗涤并加入碱性磷酸酶(ALP)标记的羊抗小鼠IgG，可得到与目标物成反比的“BSAG目标物GAbGIgG(ALP)”。ALP能够将磷酸化抗坏血酸(AAP)去磷酸化，生成具有还原性的抗坏血酸(AA)，能够将Cu2＋还原为Cu＋，进而用于CuAAC点击化学反应，使修饰有叠氮分子(azide)的磁颗粒与修饰有炔分子(alkyne)的磁颗粒聚集。

该MRS生物传感器分为两种模式(aMRS和nMRS)：aMRS模式是基于MNP30Gazide与MNP30Galkyne经CuAAC催化变为聚集状态，产生T2信号变化；nMRS是基于MNP30Gazide与MNP1000Galkyne经CuAAC催化变为聚集状态，进而通过磁分离得到未反应的MNP30Gazide(磁分离速度不同)，并对其进行T2信号读出，此模式是基于磁颗粒数量的变化。研究结果表明，该传感器能够实现食品基质中兽药残留的快速高灵敏检测，其线性检测范围为0.1~500ng/mL，检出限为0.02ng/mL，并且所提供的双模式分析有效拓宽了该生物传感器的适用性与实用性，为食品安全领域中农兽药残留及其他领域中有害小分子的快速检测提供了有力的工具。

声明：本文所用图片、文字来源《华中农业大学学报》，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：磷酸，催化，检测

【下载地址】本站专属下载器：点击下方链接 即可享受高速下载和在线播放 专治迅雷无法下载